中国血吸虫病防治杂志 ›› 2015, Vol. 27 ›› Issue (3): 285-.DOI: 10.16250/j.32.1374.2015025
寇景轩|赵桂华|魏庆宽|徐超|朱嵩|尹昆*
KOU Jing-xuan| ZHAO Gui-hua|WEI Qing-kuan| XU Chao|ZHU Song| YIN Kun*
摘要: 目的 目的 克隆刚地弓形虫强毒RH株的表面抗原免疫作图蛋白1 (Immune mapped protein?1, IMP1), 并对其进行原 核表达纯化、 鉴定。方法 方法 采用逆转录法合成刚地弓形虫RH株的第一链cDNA, 以此为模板, 用PCR法扩增野生型IMP1 基因的最大开放阅读框 (ORF) 序列, TA克隆测序鉴定后, 插入原核表达载体pET28b中, 构建重组表达载体pET28b? IMP1, 经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3), 经异丙基硫代?β?D?半乳糖苷 (IPTG) 诱导表达携带6 × 组 氨酸标签的IMP1融合蛋白, 改变温度、 诱导时间和IPTG浓度以优化诱导表达条件并测定蛋白可溶性, 通过镍离子螯合 (Ni 2+ ?NTA) 亲和层析纯化IMP1融合蛋白, 经Western blotting验证重组蛋白的特异性。结果 结果 在弓形虫RH株速殖子cD? NA中成功调取了IMP1基因的ORF序列, 并通过TA克隆和测序鉴定了IMP1基因的正确性, 在此基础上构建了原核表达 重组质粒pET28b?IMP1, 经双酶切和测序验证了重组载体的正确性, 并通过条件筛选确定了IMP1的最佳表达条件为 20 ℃下0.3 mmol/L IPTG诱导9 h。经镍柱亲和层析纯化后, IMP1全蛋白表达量和可溶性均较好, 与镍柱填料有较高的亲 和力, 能实现高效纯化。经SDS?PAGE及 Western blotting鉴定, IMP1具有良好的免疫活性。结论 结论 新型强毒弓形虫RH 株的表面抗原IMP1可在大肠杆菌原核表达系统中高效表达, 全长蛋白可溶, 性状稳定。本研究为进一步制备IMP1多克 隆抗体, 进行后续的体内表达研究以及抗弓形虫感染亚单位疫苗的构建和IMP1晶体结构研究奠定了基础。
中图分类号: